專(zhuān)利名稱(chēng)：一種聚多糖基組織工程大孔支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程與生物材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于聚多糖衍生物的組織 工程大孔支架的制備方法。
背景技術(shù)：
支架是組織工程方法修復(fù)或再生缺損組織器官的關(guān)鍵要素之一。作為在體內(nèi)、 外培養(yǎng)細(xì)胞的臨時(shí)載體，不但要具有一定的機(jī)械強(qiáng)度、良好的生物相容性和可控的降解 速率，而且要能夠提供細(xì)胞和新生組織器官生長(zhǎng)的合理三維空間結(jié)構(gòu)。目前，將生物可降解材料加工成多孔支架的主要成型技術(shù)有纖維黏結(jié)法、固體 占位致孔法、氣體發(fā)泡、相分離/冷凍干燥法等，這些方法各有利弊。纖維黏結(jié)法雖然 能制備出高孔隙率且連通性好的支架，但存在有機(jī)溶劑殘留問(wèn)題。固體占位致孔法是一 種簡(jiǎn)單易行的方法，通過(guò)選擇不同粒徑的致孔劑和使用量來(lái)有效控制孔尺寸和孔隙率， 但是致孔劑(如蔗糖、NaCl晶體)需要通過(guò)加熱、溶解的方法去除，而且容易形成盲孔， 孔的通透性還有待改善。氣體發(fā)泡法最大的優(yōu)點(diǎn)在于不需要有機(jī)溶劑和高溫，但所使用 的高壓氣體如C02容易使支架內(nèi)部生成封閉的孔，成形工藝也比較復(fù)雜。冷凍干燥法在 低溫下操作，有利于生物活性分子的引入和控制釋放。由于要將體系溶液用液氮?jiǎng)±浠?迅速降低到很低的溫度，制備的支架比較脆弱，孔徑偏小。組織工程支架是否具有合適 孔徑分布的開(kāi)放孔結(jié)構(gòu)和高孔隙率是非常重要的，因?yàn)檫@直接關(guān)系到細(xì)胞能否生長(zhǎng)到支 架內(nèi)部以及支架外的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞代謝物的交換。因此，開(kāi)發(fā)一種新的具有高孔隙率 和良好孔道貫通性的大孔型組織工程支架的制備方法，具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種基于聚多糖衍生物的組織工程大孔支架 的制備方法，該大孔型組織工程支架具有高孔隙率和良好孔道貫通性。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種聚多糖基組織工程大孔支架的制備方法，包括如下步驟(1)將聚多糖衍生物配制成濃度為0.02 O.lg/mL的單體水溶液；所述的聚多糖 衍生物為兩種不同的天然多糖經(jīng)化學(xué)改性后分別得到的可交聯(lián)的大分子單體A和大分子 單體B的組合。(2)將上述單體水溶液預(yù)冷至0 4°C，加入催化劑后迅速將反應(yīng)液置于冷凍系 統(tǒng)中冷卻結(jié)晶并進(jìn)行原位聚合，反應(yīng)完成后在室溫下融化冰晶，冰晶融化后形成孔隙， 即得到海綿狀的聚多糖基組織工程大孔支架。進(jìn)一步，本發(fā)明所述的經(jīng)化學(xué)改性的可交聯(lián)的聚多糖衍生物大分子單體A優(yōu)選 為經(jīng)化學(xué)改性的葡聚糖衍生物，即對(duì)葡聚糖進(jìn)行化學(xué)改性后的產(chǎn)物；所述的經(jīng)化學(xué)改性 的可交聯(lián)的聚多糖衍生物大分子單體B優(yōu)選為經(jīng)化學(xué)改性的透明質(zhì)酸衍生物，即對(duì)透明 質(zhì)酸進(jìn)行化學(xué)改性后的產(chǎn)物。
更進(jìn)一步，所述的經(jīng)化學(xué)改性的可交聯(lián)的聚多糖衍生物大分子單體A優(yōu)選為甲 基丙烯?；揎椀钠暇厶茄苌?，即以甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)或甲基丙烯酸酐 (MA)對(duì)葡聚糖(Dextran)進(jìn)行改性得到的產(chǎn)物，記為Dex_MA ；甲基丙烯?；娜〈?(DS，即每100個(gè)多糖結(jié)構(gòu)單元含有甲基丙烯?；臄?shù)目)為 30%。更進(jìn)一步，所述的經(jīng)化學(xué)改性的可交聯(lián)的聚多糖衍生物大分子單體B優(yōu)選為甲 基丙烯酰基修飾的透明質(zhì)酸衍生物，即以甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)或甲基丙烯酸酐 (MA)對(duì)透明質(zhì)酸(HA)進(jìn)行改性得到的產(chǎn)物，記為HA-MA;甲基丙烯?；娜〈葍?yōu) 選 35%。本發(fā)明適用的葡聚糖的分子量范圍為10 500kDa。本發(fā)明適用的透明質(zhì)酸的分子量范圍為100 lOOOkDa。本發(fā)明中，所述的兩種單體的比例依透明質(zhì)酸衍生物的含量而定，由于透明質(zhì) 酸粘度大，其衍生物在單體水溶液中的濃度優(yōu)選為0.005 0.03g/mL。所述的步驟(2)中，所述的催化劑要針對(duì)不同的聚合物單體進(jìn)行選擇，常為相 應(yīng)聚合反應(yīng)的引發(fā)劑和/或加速劑，針對(duì)本發(fā)明所具體使用的聚多糖衍生物單體，催化 劑可選用下列組合之一過(guò)硫酸銨(APS)/四甲基乙二胺(TEMED)，過(guò)硫酸鉀/三乙醇 胺；本發(fā)明優(yōu)選過(guò)硫酸銨/四甲基乙二胺作為催化劑。進(jìn)一步，催化劑與聚多糖衍生物 的投料質(zhì)量比為0.01 0.1 1。所述的步驟(2)中，反應(yīng)液可以選擇在-30 _5°C冷凍系統(tǒng)中冷卻結(jié)晶和原位聚 合反應(yīng)。在步驟(2)反應(yīng)結(jié)束后，可進(jìn)行如下處理依次用水或低濃度乙醇水溶液、 0.05MNa()H水溶液或pH8的磷酸鹽緩沖液、大量的去離子水進(jìn)行沖洗，以除去殘留的 催化劑和未反應(yīng)的單體，確保細(xì)胞支架的生物相容性。用本發(fā)明提供的制備方法得到聚多糖基組織工程支架形態(tài)為海綿狀，孔徑范圍 10 200iim，孔隙率大于80%，孔道連通性好，滲透率范圍1X10—11 3X10_9m2。吸 水速度快，5秒鐘內(nèi)即可達(dá)到溶脹平衡。單位體積含水率高達(dá)95%以上。該支架適用于 脂肪組織、皮膚、血管、心臟瓣膜等軟組織細(xì)胞或干細(xì)胞的離體培養(yǎng)。本發(fā)明提供的組織工程支架的制備方法具有如下特點(diǎn)(1)利用葡聚糖和透明質(zhì)酸的化學(xué)改性衍生物作為聚合物單體，透明質(zhì)酸為細(xì)胞 外基質(zhì)的組要成分，生物相容性良好，有利于細(xì)胞的增值和分化。經(jīng)化學(xué)改性后的透明 質(zhì)酸與葡聚糖交聯(lián)可彌補(bǔ)透明質(zhì)酸支架機(jī)械強(qiáng)度差的缺點(diǎn)，并且不需要另外加入交聯(lián)劑 便可形成支架的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。(2)利用溶劑水的結(jié)晶融化來(lái)致孔，不會(huì)造成大多數(shù)常規(guī)方法帶來(lái)的有機(jī)溶劑殘 留問(wèn)題，且通過(guò)改變冷凍溫度和單體濃度可以有效地控制孔徑大小和孔隙率。(3)單體溶液在模具中發(fā)生原位聚合反應(yīng)形成支架，因此可以通過(guò)設(shè)計(jì)各種不同 構(gòu)造的模具來(lái)制備與缺損組織器官外形相匹配的支架載體。
具體實(shí)施例方式以下以具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此實(shí)施例1
將O.lg葡聚糖衍生物Dex_MA(分子量40kDa，取代度10%)，0.05g透明質(zhì)酸 衍生物HA_MA(分子量750kDa，取代度20% )溶于5ml去離子水中，攪拌均勻后冷卻至 0°C,迅速加入6mgAPS和3mgTEMED，將所得混合液裝入內(nèi)徑10mm、長(zhǎng)100mm的玻 璃層析柱內(nèi)，密封后，在_15°C恒溫冷卻系統(tǒng)中進(jìn)行冷卻結(jié)晶致孔。反應(yīng)過(guò)夜后取出，在 室溫下融化冰晶，得到葡聚糖和透明質(zhì)酸復(fù)合的大孔組織工程支架，其孔隙率為98%， 孔徑范圍10 200 iim，平均孔徑約為80iim，孔隙率87%，孔道連通性好，滲透率范圍 2.3X10_10m2。吸水速度快，5秒鐘內(nèi)即可達(dá)到溶脹平衡。單位體積含水率高達(dá)95.0%，

圖1為支架冷凍干燥后的SEM圖。實(shí)施例2將0.15g葡聚糖衍生物Dex_MA(分子量70kDa，取代度16%)，O.lg透明質(zhì)酸衍 生物HA_MA(分子量lOOOkDa，取代度25% )溶于5ml去離子水中，攪拌均勻后冷卻至 2°C，迅速加入1.5mg APS和lmg TEMED將所得混合液裝入內(nèi)徑10mm、長(zhǎng)100mm的玻 璃層析柱內(nèi)，密封后，在_15°C恒溫冷卻系統(tǒng)中進(jìn)行冷卻結(jié)晶致孔。反應(yīng)過(guò)夜后取出，在 室溫下融化冰晶，得到葡聚糖和透明質(zhì)酸復(fù)合的大孔組織工程支架，其孔隙率為95%， 孔徑范圍10 120 iim，平均孔徑約為60iim，孔隙率82%，孔道連通性好，滲透率范 圍lXKr11!!!2。吸水速度快，5秒鐘內(nèi)即可達(dá)到溶脹平衡，單位體積含水率高達(dá)97.2%。 圖2為支架冷凍干燥后的SEM圖。實(shí)施例3將0.15g葡聚糖衍生物Dex_MA(分子量10kDa，取代度30%)，0.05g透明質(zhì) 酸衍生物HA_MA(分子量1000kDa，取代度30% )溶于5ml去離子水中，攪拌均勻后冷 卻至0°C，迅速加入14mg APS和6mg TEMED將所得混合液裝入內(nèi)徑10mm、長(zhǎng)100mm
的玻璃層析柱內(nèi)，密封后，在_12°C恒溫冷卻系統(tǒng)中進(jìn)行冷卻結(jié)晶致孔。反應(yīng)過(guò)夜后取 出，在室溫下融化冰晶，得到葡聚糖和透明質(zhì)酸復(fù)合的大孔組織工程支架，其孔隙率為 93%,孔徑范圍10 140 iim平均孔徑約為65 iim，孔隙率85%，孔道連通性好，滲透 率2X10_10m2。吸水速度快，5秒鐘內(nèi)即可達(dá)到溶脹平衡。單位體積含水率高達(dá)96.3%。 圖3為支架臨界點(diǎn)干燥后的SEM圖。實(shí)施例4將0.25g葡聚糖衍生物Dex_MA(分子量500kDa，取代度8%)，0.15g透明質(zhì) 酸衍生物HA_MA(分子量lOOkDa，取代度13% )溶于5ml去離子水中，攪拌均勻后冷 卻至4°C，迅速加入8mg APS和4mg TEMED將所得混合液裝入內(nèi)徑10mm、長(zhǎng)100mm
的玻璃層析柱內(nèi)，密封后，在-20°C恒溫冷卻系統(tǒng)中進(jìn)行冷卻結(jié)晶致孔。反應(yīng)過(guò)夜后取 出，在室溫下融化冰晶，得到葡聚糖和透明質(zhì)酸復(fù)合的大孔組織工程支架，其孔隙率為 88%,孔徑范圍10 110 iim平均孔徑約為40 iim，孔隙率89%，孔道連通性好，滲透 率3X10_9m2。吸水速度快，5秒鐘內(nèi)即可達(dá)到溶脹平衡，單位體積含水率高達(dá)95.5%。 圖4為支架臨界點(diǎn)干燥后的SEM圖。
權(quán)利要求
1.一種聚多糖基組織工程大孔支架的制備方法，包括如下步驟(1)將聚多糖衍生物配制成濃度為0.02 O.lg/mL的單體水溶液；所述的聚多糖衍生 物為兩種不同的天然多糖經(jīng)化學(xué)改性后分別得到的可交聯(lián)的大分子單體A和大分子單體 B的組合；(2)將上述單體水溶液預(yù)冷至O 4°C，加入催化劑后迅速將反應(yīng)液置于冷凍系統(tǒng)中 冷卻結(jié)晶并進(jìn)行原位聚合，反應(yīng)完成后在室溫下融化冰晶，冰晶融化后形成孔隙，即得 到海綿狀的聚多糖基組織工程大孔支架。
2.如權(quán)利要求1所述的聚多糖基組織工程大孔支架的制備方法，其特征在于所述 的大分子單體A為經(jīng)化學(xué)改性的葡聚糖衍生物；所述的大分子單體B為經(jīng)化學(xué)改性的透 明質(zhì)酸衍生物。
3.如權(quán)利要求2所述的聚多糖基組織工程大孔支架的制備方法，其特征在于所述 的大分子單體A為甲基丙烯?；揎椀钠暇厶茄苌?，甲基丙烯?；娜〈葹? 30% ；所述的大分子單體B為甲基丙烯?；揎椀耐该髻|(zhì)酸衍生物，甲基丙烯?；娜?代度為 35%。
4.如權(quán)利要求2或3所述的聚多糖基組織工程大孔支架的制備方法，其特征在于葡 聚糖的分子量范圍為10 500kDa ；透明質(zhì)酸的分子量范圍為100 lOOOkDa。
5.如權(quán)利要求2或3所述的聚多糖基組織工程大孔支架的制備方法，其特征在于所述 的單體水溶液中，大分子單體B的濃度在0.005 0.03g/mL。
6.如權(quán)利要求2或3所述的聚多糖基組織工程大孔支架的制備方法，其特征在于步驟 (2)所述的催化劑為下列組合之一過(guò)硫酸銨/四甲基乙二胺，過(guò)硫酸鉀/三乙醇胺。
7.如權(quán)利要求6所述的聚多糖基組織工程大孔支架的制備方法，其特征在于步驟(2) 所述的催化劑與聚多糖衍生物的投料質(zhì)量比為0.01 0.1 1。
8.如權(quán)利要求1 3之一所述的聚多糖基組織工程大孔支架的制備方法，其特征在于 步驟(2)中的反應(yīng)液在-30 -5°C范圍內(nèi)冷卻結(jié)晶并進(jìn)行原位聚合反應(yīng)。
全文摘要
一種聚多糖基組織工程大孔支架的制備方法，包括如下步驟(1)將聚多糖衍生物配制成濃度為0.02～0.1g/mL的單體水溶液；所述的聚多糖衍生物為兩種不同的天然多糖經(jīng)化學(xué)改性后分別得到的可交聯(lián)的大分子單體A和大分子單體B的組合。(2)將上述單體水溶液預(yù)冷至0～4℃，加入催化劑后迅速將反應(yīng)液置于冷凍系統(tǒng)中冷卻結(jié)晶并進(jìn)行原位聚合，反應(yīng)完成后在室溫下融化冰晶，冰晶融化后形成孔隙，即得到海綿狀的聚多糖基組織工程大孔支架。本發(fā)明制得的大孔型組織工程支架具有高孔隙率和良好孔道貫通性的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61L27/50GK102018992SQ20101056775
公開(kāi)日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者姚克儉, 沈紹傳, 贠軍賢 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)